膜過濾處理工藝因其出水濁度低、處理效率高等優勢在污水處理中有著廣泛應用.但膜污染成為限制其長久運行的主要問題，其中膜表面生物膜形成導致的生物污染占據重要原因[2].目前膜污染防治的方法主要有: ①膜表面改性等物理法;②利用強酸、強堿、氧化劑進行清洗等化學法;③酶干擾及群體感應抑制法等生物法.物理法和化學法換膜成本高、風險大，且易造成抗性菌株的產生及新的環境與健康危害.生物法的出現為從根本上防止及控制生物淤積提供了一條可能的途徑，由于其環境友好，安全性高及可持續性等優勢在近年來迅速崛起，成為近期膜污染研究的熱點.

　　群體感應淬滅法是指通過抑制細菌之間的信號交流(群體感應，quorum sensing，QS)來控制細菌生物膜形成的方法.在群體感應調控的生物膜形成過程中，AHL類自誘導物(N-?；呓z氨酸環內酯，N-acyl homoserine lactone，AHLs)是一種非常重要的信號分子.近年來，基于群體感應淬滅理論(quorum quenching，QQ)控制膜污染的生物法受到廣泛關注. Oh等嘗試將能分解AHLs的重組大腸桿菌封裝入中空纖維膜的微孔中，有效控制了生物淤積. Kim等從MBR活性污泥及膜表面泥餅層中分離出紅球屬菌(Rhodococcus sp. BH4)，通過制成細胞包埋珠有效驗證了其群體感應淬滅效應.

　　然而，目前應用于膜污染防治的群體感應淬滅菌只有為數幾株且分解信號分子AHLs的種類有限，在不同污水環境中，對膜污染的防治效果仍處于探索階段.更多用于膜污染防治的群體感應淬滅菌仍待進一步分離.本研究從實際污水處理廠活性污泥中分離純化出1株群體淬滅功能菌株蠟樣芽孢桿菌HG10，該種菌在土壤、生活污水和垃圾滲濾液等環境中均有發現且已被證實具有群體感應淬滅功能.但目前關于該菌在防止膜污染方面的研究尚未見報道;基于此，本實驗通過對菌株HG10進行包埋固定，驗證其群體感應淬滅功能在控制生物膜形成方面的可行性及效果，以期為該種菌在膜污染防治中應用提供數據參考和理論依據.

　　1 材料與方法

???????1.1 材料

?????? 1.1.1 樣品來源

　　用于菌株分離的活性污泥樣取自深圳某污水處理廠.

　　1.1.2 LB培養基

　　蛋白胨10 g、酵母膏粉5 g、氯化鈉5 g、葡萄糖1 g;蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min，保存備用.固體培養基加瓊脂1.5%. 1/2 LB培養基的各成分含量為上述0.5倍.

　　1.1.3 試劑及菌株

　　N-乙酰高絲氨酸環內酯(C6-HSL)和N-癸酰高絲氨酸環內酯(C10-HSL)均購于Cayman Chemical (USA);PCR反應所用Premix Taq混合酶購于TaKaRa (Japan);包埋菌株所用載體為海藻酸鈉(aladdin，AR);實驗所用微濾膜為Millipore微孔過濾膜(GVWP04700，0.22 μm，47 mm);報告菌Chromobacterium violaceum CV026和Chromobacterium violaceum VIR07為實驗室保存;人工配置污水配方如表 1.

　　　表 1 合成污水配方

　　1.2 菌株分離純化

　　采用基本培養基法定向分離具有QQ功能的細菌，配置C6-HSL (2.5 mmol ·L-1)為唯一碳源的基本培養基，將污泥2 μL接種于100 μL基本培養基中，恒溫振蕩(700 r ·min-1，30℃)培養3 d后，取1 μL接種到新的C6-HSL為唯一碳源的基本培養基中，將連續3次富集培養后的菌液涂布于LB瓊脂培養基30℃恒溫培養，于培養24 h、48 h時挑取不同形態單菌落進行分離純化.對所有分離菌落進行QQ功能檢測.

　　1.3 分離菌株QQ和QS功能檢測

　　使用報告菌CV026對分離菌株進行QQ功能檢測:滴加的樣品中含有C6-HSL時，含有報告株CV026的LB培養基上呈現紫色反應.將分離菌株于1/2 LB培養基前培養12 h后，取菌液以1 :100體積比轉接到新的1/2 LB培養基中(其中含有濃度為10 μmol ·L-1的C6-HSL溶液);在30℃，170 r ·min-1條件下培養8、10、12、24 h時，取菌液500 μL并離心(13 500 r ·min-1, 5 min)，上清液經0.22 μm濾膜過濾后-20℃凍存;將無菌濾紙片放置于含有CV026的LB平板上，在濾紙片上滴加凍存濾液20 μL后，將LB平板恒溫30℃培養24 h，觀察濾紙周圍顯色反應.

　　分離細菌的QS功能檢測，使用CV026和VIR07為報告菌，分別對短鏈類AHLs (C4-C8)和長鏈類AHLs (C10-C16)進行驗證.將分離純化的QQ菌株菌落與報告菌CV026和VIR07以“T”型劃線的方式接種于同一LB平板，恒溫(30℃)培養24 h后觀察報告菌顯色反應. 10 μL的C6-HSL和C10-HSL (10 μmol ·L-1)分別被劃線在指示菌平板上，作為對照.

　　1.4 QQ菌株16S rRNA基因序列測定

　　使用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和1492R (5′-GGCTACCTTGTTACGAC TT-3′)進行目的基因片段擴增.擴增條件: 94℃預變性3 min，94℃變性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35次循環，最后72℃延伸10 min.將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后由華大公司進行基因測序，測定序列通過GenBank數據庫比對鑒定.

　　1.5 菌株固定化及QQ功能驗證

　　菌株HG10與質量-體積濃度為4%的海藻酸鈉溶液(SA)按100 mg ·mL-1比例混勻后，滴加到質量-體積濃度為3%的CaCl2溶液中，4℃交聯后低溫保存.制備無細菌包埋的空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)為對照組，以探究包埋珠對群體感應信號分子的物理吸附作用.

　　配置C6-HSL濃度為10 μmol ·L-1的LB培養基20 mL，設置3組實驗:加入8顆海藻酸鈉細菌包埋珠(SA-HG10)的培養基，加入8顆無細菌包埋的空海藻酸鈉珠的培養基(Vacant-beads)，不加任何包埋珠的培養基作為空白對照(Control). 3組實驗在70 r ·min-1，30℃條件下振蕩培養，分別于15、17、19、21、24、26、34、54 h進行取樣，并依據1.2節群體淬滅檢測所述方法，測量紫色圓直徑，根據公式(1)計算投加不同包埋珠的C6-HSL濃度隨時間的變化情況.

　　式中，c為C6-HSL濃度(μmol ·L-1);x為顯紫色圓直徑(mm).

　　1.6 生物膜生長鑒定

　　將PVDF材質微濾膜片放入錐形瓶中，依次加入49 mL合成污水，1 mL實驗室馴化良好的活性污泥(MLSS=10 g ·L-1)，1.4節實驗結果證明無細菌包埋的海藻酸鈉珠對C6-HSL的降解能力與空白對照組無顯著差異可忽略不計(2.2節)，故本節設置兩組實驗:不加包埋珠的錐形瓶作為對照組(A)，投加15顆SA-HG10的錐形瓶作為實驗組(B).在70 r ·min-1恒溫(30℃)條件下培養，每24 h進行人工配置污水更換，以提供反應系中微生物生長所需營養成分.經過一個生物膜生長周期8 d后，取出微濾膜片，進行膜通量和生物膜EPS測量.

　　膜通量測定采用超濾杯(UFSC05001，Amicon，USA)自行搭建(圖 1)，氮氣提供穩定正壓15 kPa±1 kPa，膜片置于超濾杯膜固定裝置內，采用超純水(MilliQ water)作為過濾用水，過濾體積為50 mL，使用量筒和秒表分別記錄過濾水量和所需時間.

圖 1 膜通量測定裝置示意

　　膜表面生物膜中EPS的提取，采用熱提取法:將反應后膜片剪碎于15 mL 0.9% NaCl溶液中，超聲10 min，150 r ·min-1搖勻10 min，超聲5 min，80℃水浴30 min，取出碎膜片后，12 000 r ·min-1離心20 min，取上清液測定EPS含量，EPS總量用多糖與蛋白質之和表征.多糖和蛋白質分別采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法進行測定.

　　2 結果與討論

??????? 2.1 QQ功能菌株分離及鑒定結果

　　本研究共分離18株優勢菌，對分離菌株全部進行群體感應淬滅功能驗證，得到5株具有群體淬滅功能的細菌. 圖 2為培養24 h時5株細菌的QQ功能檢驗，菌株HG10、A51、B1和B72培養24 h時，其上清液在濾紙周圍無顯紫色反應，表明菌株在24 h內可將C6-HSL完全分解;而菌株C48在培養24 h后，其上清液在濾紙片周圍出現部分紫色，表明C48在培養24 h時能分解部分C6-HSL，群體淬滅功能較弱. 5種分離菌的16S rRNA基因鑒定結果如表 2所示.

培養時間: 24 h, C6-HSL溶液(10 μmol ·L-1)和超純水分別為陽性對照和陰性對照

圖 2 分離5種細菌的群體淬滅功能驗證

?

　　　　表 2 已分離群體感應淬滅菌株

?　　在天然環境中存在同時具有QS和QQ功能的細菌，對分離菌株的QS功能進行檢測.結果如圖 3，同屬于Burkholderia sp.屬的B72和C48自身可產生信號分子AHLs，其中菌株B72自身可生產短鏈類信號分子，C48可同時生產短鏈類和長鏈類信號分子.排除這兩株可自身生成AHLs的細菌，并結合之前QQ功能的檢驗，從余下3種菌株HG10、B1和B51中選取分解C6-HSL能力最強的HG10作為微生物固定包埋的實驗菌種.

C6-HSL和C10-HSL作為標準樣品

圖 3 分離細菌的群體感應功能檢測

　　2.2 固定化包埋菌的QQ功能檢驗

　　微生物在固定化包埋過程中，海藻酸鈉溶液濃度、交聯時間及交聯劑濃度等包埋條件均會影響固定化微生物性能，導致包埋菌活性降低. 圖 4為投放SA-HG10和空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)的LB培養基中，C6-HSL濃度隨時間的變化曲線.含有菌株HG10的海藻酸鈉包埋珠在培養17、19和21 h時，對溶液中C6-HSL的降解率分別為85%、96%和99%，表現出極強的群體感應淬滅功能;投放空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)的一組C6-HSL減少量僅為20%~26%，這可能是由于空海藻酸鈉珠的物理吸附作用造成. Khan等在對甲基狀芽孢桿菌研究中得出類似結果:在培養時間為16~23 h內，甲基狀芽孢桿菌對信號分子C12-HSL的降解率可達到90%~96%.本研究中，用海藻酸鈉固定的菌株HG10在24 h對信號分子C6-HSL降解率達到99%以上，具有極強的群體淬滅功能.

圖 4 細菌包埋珠(SA-HG10)、無細菌空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)對C6-HSL降解能力檢測

　　2.3 固定化菌株對膜污染的控制研究

?????? 2.3.1 微濾膜片外觀變化

　　于錐形瓶中取出培養8 d后的過濾膜片，微濾膜片表觀外貌如圖 5所示.未投加包埋珠的對照組A膜表面觀察到明顯的鞭毛狀絮體，已形成成熟生物膜.實驗組B濾膜表面微生物絮體附著量較少，表明投加SA-HG10細菌包埋珠對濾膜表面微生物的附著生長產生了抑制作用，進而控制膜污染的加劇.

A組和B組分別為未投加包埋珠和投加細菌包埋珠SA-HG10的測試濾膜，下同

圖 5 不同實驗條件下過濾膜片對比

　　2.3.2 膜通量變化

　　圖 6為不同反應體系中微濾膜過濾液體積隨時間的變化曲線，相比于新膜片過濾50 mL超純水需要90 s時間，實驗組B需要653 s，未投加任何包埋珠的對照組A則需更長時間(1 070 s)，膜過濾滲透性能開始下降，已出現明顯膜污染.通過公式(2)計算不同反應體系內過濾膜通量.

　　式中，LMH為膜通量[L ·(m2 ·h)-1]，V50為過濾液體積(50 mL)，A為膜有效過濾面積(13.4 cm2)，t為過濾時間(s).

圖 6 不同反應體系膜過濾性能比較

　　得出B組膜通量為181.29 L ·(m2 ·h)-1，比對照組A的110.64 L ·(m2 ·h)-1高出63.9%，表明通過群體感應淬滅機制有效提高了膜通量. Monzon等提出，環境中微生物細菌高密度聚集并通過群體感應機制形成生物膜.本研究中，群體感應淬滅菌株HG10通過抑制上述過程的發生，使膜表面微生物的附著減少，膜污染程度顯著減緩.

　　2.3.3 EPS含量變化

　　大量研究表明，生物膜中胞外聚合物(EPS)是引起膜污染的主要污染物.微生物分泌而形成的胞外聚合物中，多糖和蛋白質的含量可以占到其主要成分的60%~70%[30]，對過濾膜表面生物膜中EPS進行提取，并測定其多糖和蛋白質含量，結果如圖 7所示.對照組(A)膜表面多糖和蛋白質含量分別為11.43 μg ·cm-2和37.07 μg ·cm-2，而含有蠟樣芽孢桿菌包埋珠的實驗組(B)濾膜片上生物膜中多糖和蛋白質含量分別為8.09 μg ·cm-2和19.32 μg ·cm-2，較對照組A分別減少了29%和48%.蛋白質含量的大量減少很可能是造成生物膜形成減少的主要原因:蛋白質屬疏水性物質，Le-Clech等研究發現較多的疏水性物質將會加強微生物絮體在膜表面的附著，同時提出相對于多糖，蛋白質更易導致微生物絮體的疏水性. B組疏水性蛋白質含量較多糖減少更多，導致膜表面疏水性物質的大量減少，進而導致生物膜附著量的減少;B組胞外聚合物EPS較對照組A組減少了43%;Jiang等將海藻酸鈉包埋群體淬滅酶運用在膜生物反應器中，也發現膜組件表面EPS較對照組相比減少了大約50%，表明在本實驗中，群體感應淬滅技術對膜污染的減緩很可能是由于減少了生物膜中EPS含量而造成.具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關技術文檔。

圖 7 無細菌包埋珠的對照組(A組)和含有細菌包埋珠的實驗組(B組)過濾膜表面多糖和蛋白質含量

　　3 結論

　　(1)從實際運行的污水處理廠活性污泥中分離出1株新型群體感應淬滅菌HG10，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus.

　　(2) HG10制成的包埋珠(SA-HG10)對群體感應信號分子C6-HSL具有99%的降解能力;其投加到模擬廢水過濾系統中，提高了63.9%的膜通量，改善了膜過濾性能，為該菌在實際工程應用中節省能耗和成本提供了理論基礎.