1 引言
抗生素在醫學、農業和獸藥上的過度使用導致全球范圍內的抗生素抗性菌(以下簡稱“抗性菌”)廣泛傳播.目前，抗性菌傳播已成為全世界面臨的一個嚴重健康隱患，在土壤、水體或空氣等不同環境介質中均發現有較高比例的抗性菌或抗性基因存在.例如，對北京溫榆河流域水體中抗生素抗性大腸桿菌進行調查發現，水體中各類抗生素抗性大腸桿菌普遍存在，并且許多菌株同時具有對多種抗生素的抗性.
作為各種污水和排泄物的集中處理場所，城市污水處理廠是抗生素及抗性菌的匯集地.研究表明，城市污水處理廠出水中存在相當比例的抗性菌，是導致自然水體抗性菌污染的一個重要污染源.因此，研究和認識污水處理廠出水中抗生素抗性菌的種類和特性，對于污水處理和回用的生物風險評價和控制十分重要.目前，關于污水處理廠排放抗性菌的研究大多針對總異養菌群開展，缺乏關于菌種構成和特性的報道，因此，有必要加強相關研究.
四環素類抗生素在我國作為人用或獸用藥品被廣泛使用.本研究從城市污水處理廠二級處理出水中分離出21株四環素抗性菌株，在鑒定抗性菌菌屬的基礎上，考察各菌株的生長特性和對6種常用抗生素(青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環素和利福平)的耐藥性，以期為評估我國污水處理廠抗性菌風險提供基礎數據.
2 材料與方法
2.1 水樣
試驗水樣取自北京市某城市污水處理廠的二級處理出水，該污水處理廠主體工藝采用A2/O工藝.取樣設備均經過消毒處理，樣品保存于冰盒運回實驗室，保存于4 ℃冰箱，在4 h內進行抗性菌分離工作.
2.2 抗性菌的分離與菌屬鑒定
采用涂布法將二級處理出水接種于含16 mg · L-1四環素的營養瓊脂(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5，瓊脂15)中，于37 ℃培養箱中培養24~48 h后，挑取單個菌落于含16 mg · L-1四環素的營養瓊脂上劃線分離2次.
將所分離的菌落進行16S rRNA的PCR擴增與序列測試(TaKaRa公司).測序結果與GenBank進行比對，獲取菌株的分類菌屬.
2.3 抗性菌的質粒檢測
將所分離獲得的菌落接種于含16 mg · L-1四環素的營養肉湯培養基(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化鈉5)中，過夜培養16 h，用質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)對新鮮菌液進行質粒提取后，采用瓊脂糖凝膠電泳確定質粒是否存在.
2.4 抗性菌生長特性 2.4.1 抗性菌生長曲線測定
將所分離的菌落接種于含16 mg · L-1四環素的營養肉湯培養基中，每2 h測定OD600，12 h后每隔4~8 h測定OD600，至菌株生長進入衰亡期.
2.4.2 抗性菌生長動力學參數確定
四環素抗性菌的生長曲線呈S型，用S-Gompertz模型進行擬合，獲得四環素抗性菌的最大生長量、最大比生長速率和遲滯時間.S-Gompertz模型是細菌生長曲線擬合的常用模型，具體數學表達式如下：
式中，N為某生長時間t下細菌懸濁液在600 nm波長下的吸光度值(cm-1);N0為細菌懸濁液在600 nm波長下的初始吸光度值(低于檢測限，則初始值定為0.001)(cm-1);Nm為細菌的最大生長量，即細菌懸濁液在600 nm波長下的最大吸光度值(cm-1);μm為細菌的最大比生長速率(h-1);λ為遲滯時間(h);t為生長時間(h).
2.5 四環素抗性菌對6種典型抗生素的耐受性分析 2.5.1 抗生素母液配制
分別配制濃度為2048 mg · L-1的青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環素和利福平水溶液.溶液采用高純水配制，所配溶液用0.22 μm濾頭過膜除菌后，-20 ℃保存，時間不超過1周.
2.5.2 抗生素耐受性試驗
抗生素耐受性試驗采用微量液體稀釋法.將所分離鑒定的菌株接種于含16 mg · L-1四環素的營養肉湯培養基中，培養至對數生長期.所獲得的新鮮菌液接種于含不同濃度梯度抗生素的營養肉湯培養基中(采用96孔U型培養板)，在37 ℃經18 h培養，測定OD600.所測定抗生素包括青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環素和利福平;抗生素濃度梯度設定為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 mg · L-1.
2.5.3 抗性菌對不同抗生素的耐受性評價
用于評價的指標主要包括存活率S、最小抑制濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)、半抑制濃度IC50、抗生素抗性指數(Antibiotic Resistance Index，ARI)、典型病原抗性菌的最小抑制濃度界定最大值MICd，其定義及計算公式分別如下：
式中， OD600ji 為加入抗生素j的第i試驗組在600 nm波長下的吸光度值(cm-1)，抗生素j包括青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環素和利福平; OD′600ji 為加入抗生素j的第i組培養基在600 nm波長下的吸光度值(cm-1); OD0600 為對照組(即不加抗生素但加菌液)在600 nm波長下吸光度值(cm-1); OD′0600 為營養肉湯培養基在600 nm波長下吸光度值(cm-1).
最小抑制濃度(MIC)定義為存活率小于1%(試驗組顯色低于酶標儀檢出限)時抗生素的折點濃度.通過四參數邏輯斯蒂方程(公式(3))擬合抗生素抑制菌株的劑量效應曲線，并通過擬合曲線的參數確定半抑制濃度IC50，曲線擬合采用Origin8.0軟件完成.抗生素抗性指數ARI計算如式(4)所示.
式中，A1為無抗生素添加的效應值，設定初始值為100;A2為抗生素添加足夠多時的效應值，設定初始值為0;x0為半抑制濃度(即IC50)(mg · L-1);x為添加的抗生素濃度(mg · L-1);p為曲線坡度參數.
根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)抗生素試驗標準，青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、四環素和利福平對典型病原菌的最小抑制濃度界定(抗性界定)最大值MICd分別為16、32、32、32、16、4 mg · L-1.
3 結果與討論
3.1 污水處理廠二級出水中四環素抗性菌菌種構成
經過3次分離培養，從所選取污水處理廠二級出水中共獲得21株四環素抗性菌.16S rRNA鑒定結果表明，這些四環素抗性菌株分布于6個屬，結果如表 1所示.從分類學上劃分，這些菌株均屬于腸桿菌(Enterobacteriaceae)科.從菌株數來看，氣單胞菌屬、埃希氏菌屬和腸桿菌屬細菌較多.
表1 二級出水中分離出21株四環素抗性菌的屬分布
氣單胞菌屬于革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧條件生長，屬于條件致病菌，易導致腸胃疾病及傷口感染.檸檬酸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是大腸菌群中的一類.腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧條件生長，屬于衛生部發布的《人間傳染的病原微生物名錄》中第三類病原微生物，常見于尿道和呼吸道感染中.埃希氏菌屬于革蘭氏陰性菌，大部分埃希氏桿菌為非致病性菌，只有少數(如E.coli O157：H7)具有致病性.哈夫尼菌屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧條件生長，屬于條件致病菌.克雷伯氏菌屬于革蘭氏陰性菌，是一類常見的條件致病菌，可引起肺部、尿道和軟組織感染.通過以上分析發現，污水處理廠二級出水中的四環素抗性菌大多屬于條件致病菌.這些菌攜帶有抗生素抗性或抗性升高將增加污水處理廠二級出水的風險.
3.2 四環素抗性菌質粒攜帶情況
對所分離的四環素抗性菌進行質粒提取和凝膠電泳分析，發現21株四環素抗性菌中有18株(7株氣單胞菌、5株埃希氏菌、2株腸桿菌、2株克雷伯氏菌、1株哈夫尼菌、1株檸檬酸桿菌)攜帶質粒，另外2株氣單胞菌和1株腸桿菌不攜帶質粒.不同菌種所攜的帶質粒大小不一，但均大于2 kb.有關研究表明，具有四環素抗性的革蘭氏陰性菌通常含有大質粒，且這些質粒多為結合性質粒.結合性質粒具有攜帶多種抗性基因(如其他類型抗生素、抗金屬基因)和病原因子基因(如毒素基因)的潛力.與其他類型質粒相比，結合性質粒具有較強的傳播能力.因此，城市污水處理廠出水中四環素抗性菌所攜帶質粒可能導致抗生素抗性基因的傳播.
3.3 四環素抗性菌生長特性
抗性菌的生長特性能夠反映其在環境中的增殖能力.本文分別測定了21株四環素抗性菌的生長曲線，并用S-Gompertz模型(公式(1)和(2))擬合，獲得各菌株最大生長量(Nm)、最大比生長速率(μm)和遲滯時間(λ)，具體如表 2所示.
表2 四環素抗性菌的最大生長量(Nm)、最大比生長速率(μm)和遲滯時間(λ)
由表 2可以看出，所分離的四環素抗性菌的最大生長量(以OD600計)在1.0~2.3之間，氣單胞菌、埃希氏菌的平均最大生長量顯著高于腸桿菌(p<0.05)，其他菌株間的最大生長量無顯著差別.這表明氣單胞菌和埃希氏菌利用碳源和合成菌體的能力更強、效率更高，也可能是這些菌在污水處理廠出水中種類數上占有優勢的原因.四環素抗性菌的最大比生長速率在0.6~3.49 h-1之間，氣單胞菌的最大比生長速率顯著低于埃希氏菌和檸檬酸桿菌(p<0.05)，其他菌種間的最大比生長速率無顯著差別.各菌屬的遲滯時間在統計學上無顯著差別，大部分菌株的遲滯時間在2 h以內.從單一菌種來看，個別菌株的遲滯時間較長，有3株氣單胞菌的遲滯時間大于6 h，1株埃希氏菌的遲滯時間接近10 h.
3.4 四環素抗性菌對不同抗生素的耐受性 3.4.1 最小抑制濃度
從污水處理廠出水中分離出的21株四環素抗性菌對6種抗生素的最小抑制濃度分布如圖 1所示.由圖 1可知，所分離的21株四環素抗性菌中，有20株菌對氯霉素的MIC和10株(含)以上菌對青霉素、氨芐青霉素和頭孢噻吩的MIC不小于1024 mg · L-1，這說明污水中四環素抗性菌對氯霉素和β-內酰胺酶類抗生素(青霉素、氨芐青霉素和頭孢噻吩)的耐受能力普遍較高.同時，21株四環素抗性菌對四環素的MIC主要集中在256 mg · L-1左右，對利福平的MIC呈兩極分布.綜上所述，分離所得的21株四環素抗性菌對氯霉素的耐受能力最強，對β-內酰胺酶類抗生素的耐受性次之，對利福平的耐受性最弱.這與有關污水處理廠出水中總異養菌群對不同抗生素耐受性的研究結果類似.
圖 1 四環素抗性菌對6種抗生素的最小抑制濃度分布
與CLSI試驗標準中青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平對典型病原微生物的抗性界定濃度相比較，分別有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%四環素抗性菌株的MIC不小于抗性界定濃度，即所分離獲得的四環素抗性菌株中分別有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%的菌株具有青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平抗性.因此，污水中的四環素抗性菌同時具有多種其他抗生素抗性.
3.4.2 抗生素抗性指數
根據2.5.3節描述的方法，在大量試驗的基礎上確定了四環素抗性菌對6種抗生素的抗性指數，結果如圖 2所示.由圖 2可以看出，污水處理廠二級處理出水中四環素抗性菌對氯霉素和四環素的抗性分布較為集中，而對青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩和利福平的抗性分布范圍較寬.從抗性指數的中值來看，四環素抗性菌對不同抗生素的耐受性順序與最小抑制濃度分析結果基本相同，耐受性由高到低分別為氯霉素、青霉素、氨芐青霉素、四環素、頭孢噻吩和利福平.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
圖 2 四環素抗性菌的6種抗生素抗性分布
4 結論
1)從北京市某城市污水處理廠出水中分離出21株四環素抗性菌，經鑒定為均為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌，分別屬于氣單胞菌(9株)、埃希氏菌(5株)、腸桿菌(3株)、克雷伯氏菌(2株)、檸檬酸桿菌(1株)和哈夫尼菌(1株).其中，有18株細菌攜帶有質粒.
2)21株四環素抗性菌中，氣單胞菌、埃希氏菌的平均最大生長量顯著高于腸桿菌.四環素抗性菌的最大比生長速率在0.6~2.3 h-1之間，氣單胞菌的最大比生長速率顯著低于埃希氏菌和檸檬酸桿菌.大部分菌株的遲滯時間在2 h以內，各菌屬間無顯著差別.
3)關于最小抑制濃度和抗性指數的分析結果表明，四環素抗性菌對氯霉素的耐受能力最強，對β-內酰胺酶類抗生素的耐受性次之，對利福平的耐受性最弱.75%以上的四環素抗性菌同時表現出對其它5種抗生素(青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、氯霉素和利福平)具有抗性.
致謝： 本研究得到區域環境質量協同創新中心的支持，在此表示感謝!
