1 引言

　　人工濕地(Constructed Wetlend)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種污水處理技術，它是通過基質(zhì)-土壤-微生物的綜合作用實現(xiàn)對污染物去除，其中微生物是對污染物進行吸附和降解的主要生物群體和承擔者，微生物在濕地基質(zhì)中與其他動物和植物共生體的相互關系往往起著核心作用.由于其具有良好的污染物去除效果，可觀的經(jīng)濟效益和廣泛的適用性，已經(jīng)引起世界各國研究者的重視.

　　人工濕地中微生物的作用是凈化污水的最主要因素.微生物廣泛存在于自然生態(tài)系統(tǒng)中，根據(jù)其生長溫度特性可分為：低溫微生物、中溫微生物和高溫微生物3類.低溫微生物是指在極端低溫環(huán)境下能夠生長的微生物，它們具有獨特的生理機制和特殊的代謝產(chǎn)物，主要分為嗜冷菌(Psychrophilies)和耐冷菌(Psychrotrophs)兩類.前者是必須生活在低溫條件下，即在0 ℃下生長繁殖，最適溫度不超過15 ℃，最高溫度不超過20 ℃的微生物，后者是能在低溫條件下生長，在0～5 ℃下可生長繁殖，最高生長溫度可達20 ℃的微生物.在寒冷的冬季這些低溫微生物在人工濕地生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用，為人工濕地污水處理提供了嶄新的應用前景.

　　國外對低溫微生物處理污水技術的研究起步較早，我國從20世紀90年代初開始針對低溫微生物資源(主要是南極及深海微生物)的初步收集、調(diào)查與研究工作.目前對低溫微生物的研究與開發(fā)較少，力量還比較薄弱，其研究也沒有達到一定的深度，有關人工濕地低溫菌的研究更少.本實驗研究了低溫菌Pseudomonas flava WD-3在冬季接種到人工濕地后對污水的處理效果，并構建污水處理動力學模型，其成果必將為解決寒冷地區(qū)冬季人工濕地的污水處理提供理論基礎和技術支持，對于解決我國日益嚴重的水污染和缺水的問題有著十分重要的意義.

　　2 材料與方法

　　2.1 Pseudomonas flava WD-3 的富集培養(yǎng)、分離、篩選和鑒定

　　2.1.1 菌株的富集培養(yǎng)與分離

　　將從人工濕地中采集的泥樣(溫度10 ℃)放入4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)馴化，然后取1 g泥樣接入三角瓶中振蕩培養(yǎng)，使微生物快速生長，達到富集的作用.選取原濃度10-4～10-6倍的培養(yǎng)液各1 mL，接種于培養(yǎng)基平板上(設置3個平行)，放入8 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并記錄各平板菌株生長狀況.從中篩選出長勢較好的菌株，然后反復分離純化獲得單菌落，將單菌落接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱內(nèi)保存.

　　2.1.2 菌株的篩選

　　將分離出的單菌落富集培養(yǎng)，接種于模擬污水中，曝氣后靜置培養(yǎng)，定期測量廢水中COD、總磷和氨氮的含量，計算出各菌株對其去除率，篩選出去除效率最好的菌株E進行進一步的研究實驗.

　　2.1.3 菌株的鑒定

　　將篩選出的菌株E進行形態(tài)觀察，生理生化試驗及16S rDNA序列分析.

　　2.1.4 菌株E對廢水的去除

　　按照探究出的最適生長條件，對菌株E再次進行模擬廢水去除實驗，測量計算出其對COD、總磷和氨氮的去除效率，與實驗初期的去除效率比較，得出更加全面的實驗結論.

　　2.2 復合垂直流構建濕地結構

　　實驗構建濕地采用復合垂直流結構設計，底部相通，污水由下行池表面均勻投配，垂直下行，經(jīng)連通層到達上行池，再垂直上行，通過收集管排出.其中下行流池長150 cm，寬100 cm，深65 cm，上行流池長120 cm，寬100 cm，深55 cm，卵石層深20 cm，水力停留時間：10 d;投配負荷：2～20 cm · d-1;有機負荷：15～20 kg · hm-2 · d-1.濕地基質(zhì)選用了不同粒徑的礫石和砂土特別組配而成，濕地結構如圖 1所示，其中圖中箭頭表示污水流動方向.

　　圖 1 復合垂直流構建濕地系統(tǒng)結構示意圖

　　系統(tǒng)所選植物為除污能力強的常見濕地植物美人蕉(Canna generalis)和菖蒲(Acorus calamus)，在2012年4月份種植于人工濕地反應器中，種植密度為8株 · m-2，濕地植物生長狀況良好，已完全遮蓋基質(zhì)表面，根系發(fā)達，至實驗時為止，該系統(tǒng)已穩(wěn)定運行半年時間.系統(tǒng)進水參數(shù)見表 1.

　　表1 人工濕地系統(tǒng)進水參數(shù)

　　2.3 低溫菌Pseudomonas flava WD-3在人工濕地中的廢水處理效果

　　人工濕地系統(tǒng)穩(wěn)定運行半年后，于2013年1月中旬(水溫的變化范圍為6～8 ℃.)開始投入低溫菌Pseudomonas flava WD-3，接種量V(菌液)/V(污水)為1.5%～10%，菌懸液的濃度為4.575×108 個 · mL-1，以未接菌的人工濕地為對照組.追蹤測定氨氮、COD、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總磷的變化情況，并構建低溫菌廢水處理的動力學模型.

　　2.4 水質(zhì)指標的測定

　　氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法，亞硝酸鹽氮的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝酸鹽氮的測定采用酚二磺酸分光光度法，總磷的測定采用鉬酸銨分光光度法，CODCr的測定采用重鉻酸鉀氧化法，各指標測定的具體操作步驟詳見《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第4版).

　　3 結果與討論

　　3.1 Pseudomonas flava WD-3 的鑒定結果與模擬廢水處理效果

　　在8 ℃下培養(yǎng)菌株E表現(xiàn)為濕潤、邊緣整齊、半透明的圓形乳白色菌落，革蘭氏染色試驗菌株E呈陰性，顯微鏡下觀察為桿狀，葡萄糖氧化發(fā)酵試驗產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;蔗糖氧化發(fā)酵試驗產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;檸檬酸鹽試驗陽性;明膠水解試驗陽性;氧化酶試驗陽性;淀粉水解試驗陰性;甲基紅(MR)試驗陽性;過氧化氫酶試驗陽性;產(chǎn)H2S試驗陽性;吲哚試驗陽性.經(jīng)鑒定菌株E的16S rDNA特異序列為1424 bp，對該序列進行BLAST檢索，應用Clustal W和PHYLIP軟件分析并構建了進化樹，見圖 2.從分析結果可知，菌株E與假單胞菌同源性高達100%.因此結合該菌株的形態(tài)特征及生理生化反應特性，可初步鑒定菌株E為黃假單胞菌(Pseudomonas flava)，命名為Pseudomonas flava WD-3.

　　圖 2 菌株E的系統(tǒng)進化樹

　　該菌株對模擬廢水中COD、總磷、氨氮的降解率分別為62.92%、56.42%、50.63%，且對廢水的降解性能穩(wěn)定.

　　3.2 不同接種量情況下污水處理效果

　　在水力停留時間10 d內(nèi)，水溫為6～8 ℃時，不同接種量對復合垂直流濕地中污水的氨氮、CODCr、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和總磷去除效果如圖 3.

　　從圖 3可以看出，在1.5%～10.0%的接種量情況下，隨著低溫菌投加量的增加，濕地系統(tǒng)污水中的NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除效率也隨之增大.當投加量由1.5%增至6.0%時，濕地系統(tǒng)各項污水指標的去除效果增幅明顯，但是從6.0%至10.0%時，各項污水指標的處理效果增幅并不明顯.當菌液投加量為10.0%時，雖然各項污水指標去除效果最好，但投入過大，從運行成本方面考慮宜選用6.0%為最佳菌液投加量.

　　圖 3 濕地系統(tǒng)中NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP濃度隨時間的變化(見圖a、b、c、d、e)

　　從圖 4可以看出，當實驗菌液投加量為6.0%，水力停留時間10 d內(nèi)，水溫為6～8 ℃的條件下，隨著時間的延長，Pseudomonas flava WD-3對水質(zhì)各項指標的去除率逐漸增加，最終對NH+4-N的去除率可達83.57%，對COD的去除率可達86.31%，對NO-2-N的去除率可達95.07%，對NO-3-N的去除率可達94.74%，對TP的去除率可達84.76%，且各去除效率分別為未投加該菌的1.49、1.48、1.45、1.41、1.83倍.同時，該試驗結果表明，在人工濕地中Pseudomonas flava WD-3對污水NH+4-N、COD、TP的去除效果有明顯的提高，分別是實驗室模擬廢水處理效果的1.65、1.37、1.50倍，且去除性能穩(wěn)定.其原因可能是：人工濕地是由基質(zhì)、微生物、植物和動物所組成的復合生態(tài)系統(tǒng)，對污水起著物理、化學和生物綜合凈化功能.首先，人工濕地中的基質(zhì)(土壤、沙礫等)對污水中的污染物質(zhì)存在沉淀、吸附和簡單的機械截留等作用;第二，人工濕地系統(tǒng)中的植物對污水中污染物具有吸收和代謝的作用;第三，人為投加的Pseudomonas flava WD-3和人工濕地中土著微生物通過同化和異化作用對污水中的有機物質(zhì)、氮和磷達到去除的目的.

　　圖 4 NH+4-N、CODCr、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除率隨時間的變化

　　3.3 污水處理動力學方程

　　動力學研究可以優(yōu)化生化處理的工藝條件及調(diào)控方式，并通過建立降解動力學模型，模擬最適當?shù)墓に嚵鞒毯凸に噮?shù)，預測微生物降解廢水的趨勢.濕地設計通常采用的是一級動力學模型，其基本設計方程被澳大利亞、歐洲、美國廣泛應用于濕地的設計和對濕地的污染物去除效果的預測.雖然有局限性，但由于其參數(shù)的求解及計算過程都很簡單，因此，目前仍把它作為描述濕地中污染物去除過程的最合適的方程.

　　用于濕地的一級動力學方程，主要考慮處理負荷與處理效率之間的關系，模型的推導以基質(zhì)的降解服從一級反應動力學為基礎.污染物在人工濕地中的降解去除一級動力學模式為：

　　式(1)～(2)中，kv為污染物體積去除速率常數(shù)(d-1);Ci為進水濃度(mg · L-1);C0為出水濃度(mg · L-1);t : 水力停留時間(d).

　　根據(jù)以上動力模型，將不同投菌量時濕地系統(tǒng)出水中各污染物濃度記作C0(水力停留時間10 d內(nèi))，濕地系統(tǒng)進水濃度計作Ci，用 C0/Ci為縱坐標(無量綱污染物濃度)，以時間為橫坐標，繪制NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N和TP的時間變化曲線，如圖 5所示.同時，將各投菌量在水力停留時間第10 d時的NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N和TP的測定結果代入式(2)，計算出 kv如表 2所示.

　　通過對不同投菌量時人工濕地中各污染物的變化規(guī)律進行分析后可以看出，Pseudomonas flava WD-3在人工濕地中對污水中各污染物去除動力學符合一級動力學模型.

　　圖 5 1.5%(a)、3.0%(b)、6.0%(c)和10.0%(d)投菌量時污染物濃度隨時間的變化特點

　　表2 人工濕地中污染物的去除一級動力學速率常數(shù)kv

　　體積去除速率常數(shù)kv的大小代表著污染物降解速率的大小，在水力停留時間10 d內(nèi)，Pseudomonas flava WD-3對各污染物有著較大的降解速率，且隨著投菌量的增加，其對各污染物的降解速率也隨著增加，各kv的R2分別達0.96、0.81、0.74、0.88和0.88.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　4 結論

　　1)Pseudomonas flava WD-3對冬季人工濕地的污水具有良好的凈化效果，綜合運行成本方面考慮宜選用6.0%為最佳菌液投加量.

　　2)在最佳投加量的情況下，Pseudomonas flava WD-3對污水中NH+4-N、COD、NO-2-N、NO-3-N、TP的去除效率分別是未投加低溫的1.49、1.48、1.45、1.41、1.83倍，且去除性能穩(wěn)定.

　　3)Pseudomonas flava WD-3對污水各污染物的降解過程符合一級反應動力學模型.