1 引言
核磁共振(NMR)技術(shù)是現(xiàn)代科學(xué)中用途廣泛的分析工具，它可以快速準(zhǔn)確的用于土壤、動(dòng)植物組織、沉積物等環(huán)境樣品的分析，該技術(shù)檢測尺度和使用范圍較廣.自然界中的磷僅有一種穩(wěn)定同位素(31P)，其原子核質(zhì)量數(shù)為奇數(shù)，原子核的自旋量子數(shù)為半整數(shù)，所以在外加磁場條件下可以產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象.雖然31P-NMR技術(shù)被應(yīng)用于環(huán)境樣品有機(jī)磷分析，但有機(jī)磷提取效率較低和核磁共振圖譜質(zhì)量不高等問題仍有待于進(jìn)一步提高和完善.
有機(jī)磷是土壤及河湖沉積物的重要組成部分，在沼澤、土壤及湖泊沉積物中可以占到10%~90%.對(duì)有機(jī)磷的研究有助于人們深入認(rèn)識(shí)磷的生物地球化學(xué)循環(huán)過程及其環(huán)境效應(yīng).傳統(tǒng)的有機(jī)磷分析方法基于不同有機(jī)磷組分在酸堿提取液中的溶解性進(jìn)行分離.這些方法雖然可以為認(rèn)識(shí)磷在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化過程提供信息，但不能區(qū)分有機(jī)磷的組分及各組分在轉(zhuǎn)化過程中的作用及影響因素，從而制約了人們對(duì)有機(jī)磷的深入研究.液相31P-NMR技術(shù)最低檢出限較高，在進(jìn)行分析前必須對(duì)環(huán)境樣品的有機(jī)磷進(jìn)行濃縮處理.而土壤樣品具有復(fù)雜的物理化學(xué)性質(zhì)，且含有鐵錳等順磁性離子，這些因素會(huì)影響核磁共振分析的效率.為了達(dá)到既能獲得理想的有機(jī)磷提取效率，又可以降低提取液中的順磁性離子(Fe3+、Mn2+等)干擾的目的，一些學(xué)者嘗試用不同提取劑進(jìn)行有機(jī)磷提取，主要包括NaOH(Ahlgren et al., 2005)、離子交換樹脂(Adams and Byrne， 1989)、螯合劑+NaOH(Gressel et al., 1996)、NaOH+NaF(Sumann et al., 1998)、NaHCO3(Makarov et al., 2002)、BD(Reitzel et al., 2006)、H2SO4(Makarov et al., 2002)和EDTA+NaOH(Cade-Menun et al., 2000; Koopmans et al., 2007)等.在提取過程選擇上包括一步提取和多步提取等(Bai et al., 2009; Zhang et al., 2009).以上提取劑最初被應(yīng)用于土壤樣品分析，而沉積物有機(jī)磷的提取和分析完全借鑒于土壤科學(xué).目前仍然缺乏以高磷含量的河流沉積物為研究對(duì)象，進(jìn)行有機(jī)磷核磁共振分析的研究.
本研究以磷污染較為嚴(yán)重的海河流域滏陽新河沉積物為研究對(duì)象，參照文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合目標(biāo)沉積物理化特性，分別選擇BD、EDTA、EDTA+Na2S2O4、 C4O6H4KNa·4H2O、Na2S·9H2O和NaOH為提取劑，采用兩步提取的方式，利用液相31P-NMR技術(shù)系統(tǒng)評(píng)估不同提取劑和提取方式對(duì)沉積物樣品總磷、有機(jī)磷、金屬離子和核磁共振圖譜質(zhì)量的影響，以期在選擇和優(yōu)化理想沉積物有機(jī)磷提取劑和提取方式的基礎(chǔ)上，探索沉積物有機(jī)磷的提取機(jī)理.本研究結(jié)果將為構(gòu)建科學(xué)和普適的環(huán)境樣品有機(jī)磷分析方法體系提供重要參考.
2 材料與方法
2.1 樣品采集與處理
樣品采集自海河流域滏陽新河，滏陽新河是子牙河水系的重要河流，開挖自20世紀(jì)60年代，主要用于分流滏陽河、醴河等的洪水.隨著沿河社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量污水進(jìn)入滏陽新河，導(dǎo)致河水水質(zhì)下降.自滏陽新河上游至下游共布設(shè)5個(gè)樣點(diǎn)(1：37.500°N，115.058°E;2：37.681°N，115.665°E;3：37.827°N，115.862°E;4：37.930°N，115.967°E;5：38.117°N，116.075°E)，利用彼得遜采泥器采集表層約5 cm沉積物樣品.將樣品用密封自封袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室利用冷凍干燥機(jī)冷干樣品.剔除沉積物樣品中的雜質(zhì)后將5個(gè)樣品均勻混合，四分法取部分樣品研磨，研磨樣品過篩用于試驗(yàn)分析.
2.2 沉積物物理化學(xué)性質(zhì)分析
樣品分析指標(biāo)包括pH、有機(jī)質(zhì)(OM)、總磷(TP)、有機(jī)磷(Po)、鐵(Fe)、錳(Mn)、鋁(Al)、鈣(Ca)、鎂(Mg).pH：去CO2水與過20目篩沉積物以2.5 ∶ 1的水土比混合后pH計(jì)測定(Bai et al., 2009);TP和Po：TP的提取，將沉積物樣品置于馬弗爐中500 ℃處理2 h，樣品在干燥皿中放置常溫后使用1 mol · L-1 HCl提取16 h，沉積物無機(jī)磷(Pi)直接利用1 mol · L-1 HCl提取16 h，采用鉬酸鹽比色法分別測定提取液中的TP和Pi，沉積物有機(jī)磷(Po)為總磷和無機(jī)磷的差值(Aspila et al., 1976);OM：采用燒蝕法測定，將去除水分的沉積物樣品置于馬弗爐中550 ℃處理4 h，灼燒前后的質(zhì)量差值即為OM(Jensen et al., 1992);金屬離子測定：沉積物樣品取0.1 g過100目篩后利用微波消解儀消解(MARSXpress，CEM，USA)，消解液為HNO3-HCl-HF，樣品消解完全后加1滴HClO4趕酸，利用ICP-OES/MS測定(USEPA，2007;Wen et al., 2012).
2.3 沉積物Po提取與液相31P-NMR分析
參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，分別利用BD、EDTA和Na2S · 9H2O等提取劑進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)(表 1).提取劑分別選擇BD(0.11 mol · L-1NaHCO3+0.11 mol · L-1Na2S2O4)，EDTA(50 mmol · L-1)，EDTA(50 mmol · L-1+Na2S2O4(2%，g/mL)，C4O6H4KNa·4H2O(0.1 mol · L-1)，Na2S · 9H2O(0.1 mol · L-1)，NaOH(0.25 mol · L-1).提取過程分為兩步：分別稱取6份等量(5 g)沉積物置于50 mL離心管，前5個(gè)樣品分別依次加入前5種提取劑，提取比例為1 ∶ 10，室溫、240 r · min-1下振蕩2 h，振蕩結(jié)束后將離心管置于冷凍離心機(jī)中4 ℃條件下8000 r · min-1離心30 min.過濾上清液用于TP、Po及金屬離子檢測，剩余沉積物與第6個(gè)樣品一同加入0.25 mol · L-1 NaOH 溶液(浸提比例為1 ∶ 10)，室溫、240 r · min-1下振蕩16 h.振蕩結(jié)束后置于冷凍離心機(jī)4 ℃條件下8000 r · min-1 離心30 min.過濾棄去沉積物殘?jiān)^濾液部分用于TP、Po及金屬離子檢測，剩余提取液冷凍干燥待用.2次提取液稀釋用于不同元素分析：TP測定需要首先利用過硫酸鉀高溫消解，提取液Po為TP和Pi的差值，TP和Pi含量采用化學(xué)分析儀測定含量(型號(hào): SmartChem200;廠商：德國 AMS);金屬離子利用ICP-OES/MS分析;剩余提取液冷凍干燥機(jī)冷干至粉末，冷藏待用.
表 1 沉積物有機(jī)磷提取劑及提取過程
?液相31P-NMR磷最低檢出限較高，為了保證不同提取液提取后核磁共振分析可以獲得理想的圖譜，用0.1 mL 10 mol · L-1NaOH+0.6 mL D2O的混合溶液溶解300 mg冷凍樣品.混合溶液超聲處理30 min，超聲結(jié)束后靜止平衡5 min，平衡結(jié)束后樣品溶液14000 r · min-1離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至核磁共振管檢測.檢測儀器為瑞士BRUKER公司生產(chǎn)的BRUKER AV400核磁共振儀.采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5 mm的BBO探頭，31P譜的脈沖P1=12.00 usec，脈沖功率PL1=3.00 dB，31P的共振頻率為129.534 Hz，循環(huán)延遲dl=2 s，掃描20000次左右，測定溫度為20 ℃.化學(xué)位移均參照85%的H3PO4，樣品檢測所得峰值參考已發(fā)表文獻(xiàn)確定不同成分化學(xué)位移的組成(Turner et al., 2003; Cade-Menun.，2005)，對(duì)不同組分圖譜進(jìn)行積分，用于計(jì)算沉積物中不同組分有機(jī)磷的含量.
3 結(jié)果與討論
3.1 沉積物物理化學(xué)特征
沉積物樣品基本理化性質(zhì)如表 2所示.點(diǎn)面源污染物排放的加劇增加了河流沉積物磷的累積，本研究樣品沉積物總磷高達(dá)(4228.86±98.11)mg · kg-1，其中有機(jī)磷含量為(535.35±23.09)mg · kg-1，有機(jī)磷占到沉積物總磷的12.66%;沉積物OM值較高，為12.09%±1.18%.滏陽新河沿岸農(nóng)田廣布、人口密集、城鎮(zhèn)化進(jìn)程加快，產(chǎn)生了大量的工農(nóng)業(yè)及生活污水，污水?dāng)y帶了大量污染物進(jìn)入河流，導(dǎo)致河流沉積物有機(jī)質(zhì)含量較高，這一現(xiàn)象在海河流域較為普遍(Qu and Kroeze， 2010; Pernet-Coudrier et al., 2012);沉積物pH為7.25±0.31，呈弱堿性;滏陽新河沉積物Fe、Al離子濃度高于Ca離子，F(xiàn)e、Mn、Al、Ca、Mg的離子濃度分別為(57.59±1.23)、(0.63±0.11)、(27.12±2.76)、(14.15±2.87)和(3.90±0.66)g · kg-1，為典型的Fe/Al型沉積物.
表 2 河流沉積物理化性質(zhì)
?3.2 總磷(TP)和有機(jī)磷(Po)提取效率分析
不同提取劑前提取處理TP和Po的提取效率差異較大(圖 1).EDTA +Na2S2O4提取的TP量最大為(1160.52±32.00)mg · kg-1，其次為 Na2S · 9H2O提取的TP量為(846.34±18.18)mg · kg-1，BD和C4O6H4KNa · 4H2O提取的TP量分別為(322.87±13.82)和(306.42±5.09)mg · kg-1，EDTA前提取液中的TP含量最低，為(119.76±16.00)mg · kg-1.不同提取劑前提取后NaOH提取沉積物樣品所得到的TP濃度差別較大.與僅用NaOH一步提取相比，EDTA前提取后NaOH提取液中TP濃度較高，為(2477.40±112.72)mg · kg-1，BD和EDTA+Na2S2O4前提取后NaOH提取液中TP濃度分別為(2271.20±75.63)和(1909.71±31.27)mg · kg-1，與僅用NaOH提取相差不大，而其余兩個(gè)處理C4O6H4KNa·4H2O和Na2S · 9H2O前提取后NaOH提取液中TP濃度低于僅用NaOH一步提取的結(jié)果.
圖 1 不同提取液中TP和Po的含量
不同提取液處理對(duì)沉積物Po的提取效率差異明顯.5種前提取液中以Na2S · 9H2O前提取Po的損失最嚴(yán)重，損失量為(68.82±1.74)mg · kg-1，其次為C4O6H4KNa · 4H2O前提取液中Po損失量為(46.36±5.81)mg · kg-1，其余3種提取液BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po損失量基本一致，分別為(24.91±15.24)、(20.90±2.58)和(21.69±5.16)mg · kg-1.前提取液對(duì)NaOH提取Po的效率亦產(chǎn)生影響.與僅用NaOH(Po：(185.05±40.12)mg · kg-1)一步提取相比，EDTA提取后NaOH提取液中Po含量較高，為(186.93±20.53)mg · kg-1，其余4種提取劑提取后NaOH提取液中Po濃度分別為(152.04±1.55)(BD)、(157.92±46.27)(EDTA+Na2S2O4)、(121.47±21.21)(C4O6H4KNa · 4H2O)、(99.87±15.20)mg · kg-1(Na2S · 9H2O).
綜合來看，EDTA前處理顯著增加了TP的提取效率，與僅用NaOH提取對(duì)比，TP的提取量增加了10%.這一研究結(jié)論與相關(guān)研究一致(Turner et al., 2005; Ahlgern et al., 2007).EDTA作為一種應(yīng)用廣泛的螯合劑，可以與沉積物中的金屬離子(Fe、Al等)螯合形成絡(luò)合物，從而促進(jìn)了沉積物中鐵鋁結(jié)合態(tài)磷的釋放，增加了提取液中TP的濃度(Cade-Menun and Preston， 1996; Cade-Menun and Lavkulich， 1997).BD處理也可以促進(jìn)沉積物磷的釋放，其機(jī)理與EDTA不同，BD可以使高價(jià)態(tài)金屬離子還原為低價(jià)態(tài)金屬離子，低價(jià)態(tài)金屬離子對(duì)磷的吸附能力小于高價(jià)態(tài)離子從而促進(jìn)磷的釋放(Ahlgern et al., 2007).EDTA對(duì)沉積物中金屬離子的螯合作用大于BD，因此，EDTA提取液中TP的濃度顯著高于BD處理，且EDTA前提取液中TP的損失量小于BD.在本研究中，EDTA+Na2S2O4提取并沒有增加TP的提取量，且前提取液中TP損失較大.C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O兩種提取劑在TP提取上效果均較EDTA和BD差.Po的提取效率與TP類似.沉積物有機(jī)磷亦可以被Fe離子等金屬離子結(jié)合，EDTA的存在螯合了金屬離子從而促進(jìn)了有機(jī)磷的釋放(Turner et al., 2007).EDTA前處理在獲得較高Po提取量的同時(shí)Po損失量最少，而BD和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po損失量較少，但NaOH提取液中Po的提取量也較小，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O兩種提取劑對(duì)Po的提取效率低于其他處理.
3.3 金屬離子提取效率分析
沉積物有機(jī)磷提取的最優(yōu)效果是獲得較理想的有機(jī)磷提取量和低濃度的順磁性離子(Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ))，這些順磁性離子的存在會(huì)提高弛豫時(shí)間，增加譜圖的線寬使峰形重疊(Ding et al., 2010).不同提取劑Fe、Mn等5種離子的提取情況見圖 2.就Fe離子而言，EDTA+Na2S2O4前處理對(duì)Fe離子的去除效率最高，提取液中Fe離子濃度為(106677.21±215.82)mg · kg-1.5種前處理中EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mn離子濃度高于其它3個(gè)處理，分別為(243.02±2.80)和(266.61±1.84)mg · kg-1.Na2S · 9H2O前提取液中Al離子濃度最高為(217.65±7.12)mg · kg-1.5種提取劑前提取后NaOH溶液提取液中Al離子的濃度EDTA+Na2S2O和EDTA處理較高為(718.95±5.25)和(687.73±3.53)mg · kg-1，其余3個(gè)處理NaOH提取液中Al離子濃度均低于前兩個(gè)處理.EDTA和EDTA+Na2S2O4兩處理前提取液中Ca離子濃度較高，分別為(22062.99±486.93)和(18729.74±26.93)mg · kg-1.BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mg離子濃度較高，分別為(273.06±1.24)、(238.32±8.37)和(333.68±0.36)mg · kg-1，其余兩處理前提取液中Mg離子濃度較低.
圖 2 不同提取液中Fe、Mn、Al、Mg、Ca離子濃度變化
不同提取劑對(duì)順磁性離子的去除效率存在差異.EDTA是一種有效的絡(luò)合劑，擁有6個(gè)配位原子，可以和金屬離子形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，EDTA提高有機(jī)磷提取量的同時(shí)結(jié)合Fe、Mn等順磁性離子.在本研究中大量的Fe和Mn離子在EDTA提前提取中去除，從而減少了NaOH提取液中順磁性離子的干擾;BD為0.11 mol · L-1 NaHCO3和0.11 mol · L-1 Na2S2O4的混合溶液，可以將金屬離子從高價(jià)態(tài)還原成低價(jià)態(tài)從而促進(jìn)磷的釋放，在本研究中，BD對(duì)Fe、Mn等離子的提取效率均小于EDTA的提取效率;EDTA和Na2S2O4的混合溶液表現(xiàn)出了對(duì)Fe和Mn離子更高的去除效率，原因?yàn)镋DTA和強(qiáng)還原性的Na2S2O4混合保證了金屬離子的高去除率;而作為探索研究，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O對(duì)金屬離子的去除效果較差，也沒有較高的TP和Po提取效率.所以在對(duì)河流沉積物的有機(jī)磷提取中BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4對(duì)順磁性離子的去除效果較為理想.
3.4 沉積物有機(jī)磷提取圖譜分析
利用液相31P-NMR對(duì)NaOH提取液進(jìn)行分析得到5種磷組分，分別是正磷酸鹽(Ortho-P: 6~7 ppm)、焦磷酸鹽(Pyro-P：-3.5~-4.5 ppm)、磷酸單酯(Mono-P：4~6 ppm)、磷脂(Lipids-P：1~ 3 ppm)和DNA-P(DNA-P：0~-1 ppm)(圖 3).從圖譜分析可以看出，提取劑對(duì)沉積物磷形態(tài)并沒有產(chǎn)生影響，提取劑前提取后，均可以得到5種磷形態(tài). 不同提取劑對(duì)沉積物中不同磷形態(tài)含量造成的影響存在差異.EDTA和BD處理后顯著提高了沉積物NaOH提取液中Pi的提取量.EDTA處理后提高了沉積物NaOH提取液中焦磷酸的量;5種提取劑處理后并沒有提高磷酸單酯的量.EDTA、EDTA+Na2S2O4和C4O6H4KNa · 4H2O 3個(gè)處理顯著提高了磷脂的含量，分別由0.63 mg · kg-1增加到3.44、2.58和4.09 mg · kg-1;對(duì)DNA-P而言，僅EDTA處理提高了其含量(表 3).
圖 3 河流沉積物有機(jī)磷核磁共振磷化合物圖譜
表 3 液相31P-NMR檢測的河流表層沉積物不同形態(tài)磷含量
?4 結(jié)論與展望
1)從TP和Po的提取效率來看，BD和EDTA前處理能提高TP的提取效率，而且前提取液中TP的損失量較小.5種提取劑前處理Po的損失量差別不大，EDTA處理可以提高Po的提取量.綜合TP和Po來看，EDTA前處理既可以提高TP和Po的提取效率，又能保證TP和Po在前提取液中的損失量較小;核磁共振圖譜分析顯示，EDTA可以提高沉積物中正磷酸鹽、焦磷酸鹽、磷脂和DNA的含量.
2)不同的提取劑對(duì)順磁性離子Fe和Mn提取效率差異較大：與僅用NaOH提取相比，幾種提取劑前提取后對(duì)NaOH提取液中Fe離子的影響不顯著，但BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以去除大量Fe離子，從而降低沉積物中Fe離子的含量;對(duì)Mn離子而言，EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以降低沉積物中Mn離子含量，保證了NaOH提取液中Mn離子含量低于僅用NaOH提取.具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3)綜合以上3個(gè)主要指標(biāo)可以得到，對(duì)于總磷和有機(jī)磷含量均較高的河流沉積物樣品，在進(jìn)行有機(jī)磷提取分析時(shí)，采用兩步提取方法，即首先利用50 mmol · L-1 EDTA進(jìn)行前提取后利用0.25 mol · L-1 NaOH提取可以保證較理想的Po提取效率和核磁共振圖譜、較低的順磁性離子干擾，從而保證沉積物有機(jī)磷液相31P-NMR分析的科學(xué)性和有效性.
本研究基于河流沉積物樣品探究了5種常用提取劑的提取效果，取得了較為理想的結(jié)果.與目前使用范圍較廣的提取劑配比(0.25 mol · L-1 NaOH+50 mmol · L-1 EDTA)相比，本研究在探索不同提取劑提取機(jī)理和優(yōu)選更適用的提取劑方面具有科學(xué)意義，而且作者利用本文優(yōu)化的提取方法對(duì)海河流域其他河流進(jìn)行有機(jī)磷提取分析，均取得了較好的效果(未發(fā)表數(shù)據(jù)).因此，本方法完全可以應(yīng)用于高磷含量的河流沉積物有機(jī)磷分析.環(huán)境樣品理化性質(zhì)千差萬別，要想獲得較為理想的提取劑必須針對(duì)不同環(huán)境樣品進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證提取劑和提取方法的普適性.目前，我國河湖富營養(yǎng)化問題突出，在對(duì)水-沉積物界面磷的生物地球化學(xué)循環(huán)過程及影響因素等問題上仍需深入探討，而核磁共振技術(shù)可以為此提供有力的技術(shù)支持.基于以上考慮，將來可以加大提取劑的選擇范圍和擴(kuò)大環(huán)境樣品類型，以選擇理想的有機(jī)磷提取劑，優(yōu)化有機(jī)磷提取方法體系.
