1 引言
強化生物除磷技術(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)由于經濟、高效的特點被廣泛應用于各大城市污水處理廠.通過分子生物技術已經確認菌群β-Proteobacteria是EBPR活性污泥中的優勢聚磷菌(PAOs)，將其命名為C and idatus Accumulibacter(Hesselmann et al., 1999;Crocetti et al., 2000).Accumulibacter 是目前污水生物處理領域廣泛認可并且研究最多的一種PAOs(Zilles et al., 2002).ppk1基因可以編碼合成poly-P的聚合磷酸鹽激酶(PPK1)，其進化速度是16S rRNA 的5倍，是研究Accumulibacter各進化分支很好的基因標記物.McMahon等(2007)基于ppk1的系統發育分析將Type I劃分為Type I和Type II，其中，Type I 進一步劃分為IA、IB、IC、ID、IE 5個分支;Type II劃分為IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF、IIG 7個分支.
現有研究證實，Accumulibacter在污水廠存在很高的多樣性，且主要分布于TypeⅡ，但水廠運行與各分支分布的相關性不清楚.宏基因組的研究也證實了分支多樣性，這種多樣性與污水處理廠的穩定性有一定關系(Albertsen et al., 2012).Mielczarek等(2013)對丹麥28個污水處理廠的研究發現，IA和IIC分支幾乎出現在每個處理廠.Peterson等(2008)對美國幾個污水處理廠及一些淡水湖泊、河口沉積物樣品進行研究發現，IID存在于大部分的淡水、河口沉積物中及少部分污水處理廠中，有的湖泊淡水中僅發現IID 1個分支.由此可見，來自不同地域的污水處理廠，Accumulibacter進化枝的分布有明顯差異.對實際污水處理系統中Accumulibacter的研究主要發現了IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF這6個分支，尤其是前5個分支的研究報道較多(He et al., 2007; Gebremariam et al., 2011; McMahon et al., 2007; Mielczarek et al., 2013)，IIF較少存在.而在本研究中IIF在幾個污水處理系統中含量豐富，首次作為重點研究.其他6個分支(IB、IC、ID、IE、IIE、IIG)主要存在于自然界的淡水、湖泊、河流沉積物等地方，很少在實際污水處理廠中出現(McMahon et al., 2007).因此，著重關注IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF這6個分支而不是整體的12個分支.關于中國城市污水處理廠中Accumulibacter 6個分支的菌群結構及定量分析的研究尚未見報道.
近年來，許多研究者針對污水處理系統的運行參數和Accumulibacter各分支的組成分布的關系展開研究.關于電子受體的影響，Kim等(2013)認為所有桿狀的Accumulibacter分支，包括分支IIC、 IA和IIF在具有足夠的硝酸鹽還原活性的污泥中可以成功的利用硝酸鹽吸磷.Flowers等(2009)發現反硝化吸磷時，IA、IIA分別以硝酸鹽、亞硝酸鹽作電子受體.Flowers等(2013)在最近的研究中發現，在動力學上Clade IIA活性與溫度正相關，而IA與溫度呈負相關.迄今為止，究竟有哪些因素主導了實際污水處理系統Accumulibacter的種群結構和動態變化仍然沒有確切的研究結果.
本研究選擇9個具有代表性的大型市政污水處理廠，分析不同運行狀況的污水處理廠活性污泥中C and idatus Accumulibacter主要分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的豐度及分布特點，揭示污水處理廠C and idatus Accumulibacter進化枝水平菌群結構、豐度與工藝運行的相關性.
2 材料與方法
2.1 城市污水處理廠的活性污泥樣品
實驗所用的污泥樣品分別采集于9個污水處理廠，其中有2個水廠各包含2個工藝，共11個工藝.每個工藝取1個污泥樣品.其中，針對A2O+纖毛狀生物膜(CNR)工藝取2個樣品，分別位于加膜區和無膜區，是為了考察加膜對聚磷菌的菌群結構是否有影響，因此，共有12個樣品.12個樣品依次命名為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L.其中，B和C取自同一水廠，I和J取自同一水廠，E和F取自A2O+纖毛狀生物膜工藝的加膜區和無膜區.污水處理廠的運行參數及進出水指標見表 1.
表1 活性污泥樣品對應的污水處理系統的運行參數及進出水指
?2.2 DNA提取、PCR、克隆測序
用1×PBS(0.01 mol · L-1，pH=7.2~7.4)清洗污泥樣品3次，14000×g離心2 min，去除上清液，置于-20 ℃保存.采用試劑盒(Fast DNA Spin kit for soil，MP，USA)對DNA進行提取.提取后的DNA 通過Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientic，USA)測量核酸濃度及純度.
特異性正向引物ppk1-254F(TCACCACCGACGGCAAGAC)和反向引物ppk1-1376R(ACGATCATCAGCATCTTGGC)用來擴增總C and idatus Accumulibacter ppk1 基因，片段長度為1123 bp.PCR反應采用試劑盒(Promega GoTaq Green Master Mix，USA)，反應體系為25 μL：12.5 μL GoTaq Green Master Mix，1 μL(10 mmol · L-1)正向引物，1 μL(10 mmol · L-1)反向引物，0.5~2 μL DNA模板，剩余體系用純水補齊.PCR程序包括：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性45 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環;最后在72 ℃反應5 min.
獲得的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳(Agarose MS-6，TaKaRa，Japan)檢測，為單一的目的條帶，切膠，用Takara Agarose Gel DNA Purication Kit Ver. 2.0(Takara，Dalian，China)純化.得到的DNA用試劑盒(Zero Background TA Topoisomerase Cloning Kit，Clonesmarter，USA)進行連接轉化.連接體系為10 μL，包括1 μL pCloneEZ-TOPO載體，1 μL 10×Enhancer，0.5~8.0 μL DNA，一定量的純水補齊體系.連接反應完成后將產物加入到感受態細胞DH5a(中美泰和，國產)中進行轉化.每個樣品隨機挑出一定量的陽性克隆子進行測序，構建克隆文庫.
2.3 克隆文庫建立和系統發育分析
構建文庫的序列通過Mothur 軟件按照 97%相似度進行 OTU 劃分，將每個 OTU 的代表序列與NCBI 數據庫中下載的相似性最高最具代表性的菌株序列一起進行比對.采用 MEGA5.0 利用鄰接法(Neighbor Joining Method)進行系統發育分析，通過自舉分析方法(Bootstrap)檢驗系統發育樹各分支置信度，重復1000次.
2.4 實時定量PCR(QPCR)
采用特異性引物對C and idatus Accumulibacter主要的6個分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的ppk1片段和全菌的16S rRNA進行QPCR擴增(He et al., 2007; Ong et al., 2014).反應在Mx3005P實時定量PCR擴增儀(Agilent Technologies，American)上進行，采用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq kit進行反應，體系為25 μL包括12.5 μL的SYBR緩沖液，正反向引物各1 μL(10 mmol · L-1)，0.5 μL ROX，DNA模板2 μL，剩余體系用純水補齊.特異性引物序列及擴增程序見表 2.
表2 QPCR各分支的特異性引物序列及擴增程序
?本研究采用質粒法制作標準曲線.C and idatus Accumulibacter 6個分支IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF實時熒光定量 PCR 標準曲線中的初始模板濃度與Ct值之間呈現較好的線性關系，R2在0.990~1.000之間，擴增效率在92%~109.7%之間.
2.5 登錄號
測得的序列上傳至 GenBank 數據庫，獲得的聚磷菌的序列登錄號為：KP147989~KP148181、KT024045~ KT024419.
3 結果與討論
?3.1 12個活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter 的定量分析
采用實時定量PCR定量分析Accumulibacter(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)6個分支的豐度，結果如圖 1所示.Accumulibacter 6個分支均為單拷貝基因，即Accumulibacter的細胞數為ppk1基因的拷貝數.總Accumulibacter的定量變化范圍為7.32×107(D)~3.05×109 cells · g-1(L)，平均為1.20×109 cells · g-1(以MLSS計).在12個樣品中，只有D樣品數量級為107，比其他樣品低1~2個數量級，其中的Accumulibacter ppk1基因含量偏低;有6個樣品數量級為108，分別為H、B、C、I、J和K;樣品A、E、G、F和L的數量級為109，這5個樣品中的Accumulibacter的ppk1基因含量高于其他樣品，其中樣品L(A2O工藝)含量最高，達到了3.05×109 cells · g-1(以MLSS計).12個樣品中Accumulibacter占總菌的百分比變化范圍為0.58%~ 22.77%，平均為9.17%(圖 1).
?圖1 Accumulibacter豐度及占總菌的比例
Mielczarek等(2013)通過FISH技術對丹麥28個城市污水處理廠中Accumulibacter進行研究時發現，Accumulibacter占總菌的平均比例為3.7%，低于本研究結果.而He等(2008)對5個污水處理廠中Accumulibacter占總菌比例的研究結果為9%~24%，與本研究結果基本一致.
從圖 1中可以看出，樣品A、E、F、G和L中Accumulibacter的豐度均在109 cells · g-1(以MLSS計)以上，而這5個樣品中，L為A2O工藝、A為A2O+MBR工藝、E、F為A2O+NAR工藝，樣品G為倒置A2O工藝，且在5個樣品中豐度偏低.由此可見，A2O工藝及其改良工藝中Accumulibacter的豐度最高.且來自同一工藝的樣品E和F證實了在A2O工藝的基礎上加膜不會對Accumulibacter的豐度造成影響.同為氧化溝工藝的樣品H和樣品K中Accumulibacter的豐度在同一數量級上，為108 cells · g-1(以MLSS計).AO工藝的樣品J中Accumulibacter的豐度和樣品H(氧化溝)在同一數量級，和樣品G同為倒置A2O工藝的樣品I要比樣品G小一個數量級.由此判斷，倒置A2O工藝和氧化溝工藝的Accumulibacter豐度也處于比較高的水平，只有CASS工藝對應的樣品中Accumulibacter豐度明顯低于其他工藝.各個樣品中Accumulibacter占總菌的比例與各個樣品Accumulibacter的豐度變化趨勢基本保持一致.
Accumulibacter 6個分支定量結果見圖 2.6個分支在12個污泥樣品中豐度變化范圍及各分支占總Accumulibacter的變化范圍見表 3.從圖 2可以看出，Accumulibacter的6個分支中，IIC和IID處于同一數量級，為108 cells · g-1(以MLSS計)，分別占Accumulibacter總菌的比例為75.34%和14.87%，是污水處理系統中的優勢菌屬.尤其是IIC豐度達到了109 cells · g-1(以MLSS計). IIA、IIB和IIF處于同一數量級，為107cells · g-1(以MLSS計)，比IIC和IID低一個數量級，這3個分支之和占Accumulibacter 總菌的比例為9.34%.IA含量最少，數量級比IIC和IID低2個數量級，占Accumulibacter總菌的比例僅為0.32%.Accumulibacter的 6個分支均存在于每個工藝中，但Type I所占比例不到1%，而Type II接近100%.各個分支的變化基本和總Accumulibacter變化趨勢一致，與Mielczarek等(2013)的研究結論一致，不同的是Mielczarek等沒有發現任何處理廠含有Accumulibacter的5個分支(IA~IID). 本研究首次報道了IIC在9個城市污 水處理廠中豐度最高，IA在9個水廠中豐度最低，Accumulibacter的這種群落分布特點明顯不同于其他污水處理廠.Type II中的6個分支在12個污泥樣品中呈現不同的分布特點，定量結果證實了城市污水處理廠Accumulibacter進化枝水平分布的多樣性.
?圖2 Accumulibacter各進化分支豐度及相對含量
表3 12個樣品中C and idatus Accumulibacter中各進化分支的比例
?3.2 12個活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter 基于OTU的多樣性分析
9個污水處理廠，共12個樣品，構建12個ppk1基因克隆文庫進行分析.12個克隆文庫的Good 覆蓋率、Chao1 豐富度估計、OTU 值與估計的 Chao1 值之比(OTUobserved/OTUestimated)、香農指數見表 4.12個污泥樣品的ppk1基因的OTUs分布如圖 3所示.如表 4所示，12個樣品的Good覆蓋率變化范圍為71.43%~98.15%.計算的 OTU 值與估計的 Chao1 值之比除了樣品A為47.06%，其余11個樣品在62%~100%之間.Mehlig等(2013)對國外8個污水處理廠進行了研究，Good覆蓋率只有35.4%~65.4%.說明本研究的12個克隆文庫可以代表 12個樣品中Accumulibacter的群落組成.樣品A可能需要測更多的數據保證數據的可信度.
表 4同時給出了12個 ppk1 基因克隆文庫中的香農指數，根據表中結果發現，樣品C只有1個OTU，說明該樣品中ppk1基因多樣性很低，香農指數為零.另外11個樣品的香農指數在0.15~2.04之間，其中，樣品A、D、G、J和K含有較豐富的多樣性.He等(2007)對9個市政污水處理廠中Accumulibacter的群落進行研究，香農指數在0.2~1.4之間.與本研究對12個克隆文庫中Accumulibacter的群落多樣性研究相符合.
表4 克隆文庫中序列多樣性及覆蓋率
?12 個ppk1基因克隆文庫中共得到568 條 ppk1序列，按照 3% cut-off的距離劃分為 29個 OTUs. 從圖 3可以看出，樣品C僅有1個OTU，意味著樣品C中Accumulibacter的多樣性最不豐富.而樣品B和樣品I分別包含3、2個OTUs，說明這2個樣品中Accumulibacter的多樣性水平比較低.樣品A、D、G、J、H和K分別含有8、6、10、8、7和10個OTUs，具有較高的多樣性水平，樣品E、F和L均含有5個OTUs，較前6個樣品多樣性偏低.
OTU1共出現12次，即每個樣品中都有序列出現在OTU1中，同時還是樣品B、C、E、F、F、I和J共6個克隆文庫中的優勢OTUs.OTU3和OTU5在6個樣品中出現，尤其在樣品H的克隆文庫中分布廣泛.OTU7出現了4次.有4個OTUs共出現3次，分別為OTU2、OTU4、OTU6和OTU11.上述8個OTUs為Accumulibacter的主要種屬.有10個OTUs(OTU10、OTU12、OTU13、OTU15、OTU17~ OTU20、OTU22、OTU23)出現2次，有11個(OTU9、OTU10、OTU14、OTU16、OTU21、OTU24~ OTU29)共出現1次，這21個OTUs中每個OTUs包含1~2條ppk1序列，不是Accumulibacter的主要種屬.
?圖3 12個污泥樣品的ppk基因的OTU分布圖
3.3 12個活性污泥樣品中C and idatus Accumulibacter基于系統發育樹的多樣性分析
利用29個OTUs的代表序列建立的系統發育樹如圖 4所示.He等(2007)對9個市政污水處理廠中Accumulibacter的群落進行分析認為，實際污水處理廠污水組成和運行情況比較復雜會導致污水中Accumulibacter種類比較豐富，所測得的序列至少分布在3個進化枝中.Type I包括IA、IB、IC進化枝，Type II包括IIA、IIB、IIC、IID、IIF進化枝.ID、IE、IIE和IIG在淡水和河口沉積物中發現，在此不做考慮.另外，序列Rhodocyclus tenuis 作為參考序列.以往的研究均是通過各個水廠中的代表序列建系統發育樹，但本研究中采用各OTUs中代表序列建立系統發育樹，這樣更方便從整體上觀察幾個工藝中Accumulibacter的分布情況.如圖 4所示，OTUs在幾個進化枝間分布比較均勻，有27個OTUs屬于Type II型的Accumulibacter，僅有2個OTUs(共12條序列)屬于Type I型，說明實際污水除磷系統中的Accumulibacter主要以Type II型為主，與QPCR結果一致.
?圖4 基于ppk1基因的系統發育樹
結合圖 4和圖 5可知，IIA包含6個OTUs(88條序列)，IIB包含3個OTUs(6條序列)，IIC包含11個OTUs(124條序列)，IID包含4個OTUs(315條序列)，IIF包含1個OTU(共23條序列).其中，優勢OTUs(OTU1~OTU3)分別隸屬于IID、IIC、IIA.QPCR和PCR-Cloning-Sequencing的研究結果都證實了12種污水處理工藝中Type I豐度很低，主要以 Type II為主，且IIA、IIC、IID是系統中的優勢分支.
?圖5 12個污泥樣品中Accumulibacter 6個分支分布圖
3.4 C and idatus Accumulibacter各進化枝的分布與EBPR性能之間的關系
結合12個污泥樣品的QPCR分析和克隆文庫的分析可知，Type I和Type II均存在于城市污水處理廠中，以Type II為主，Type I占Accumulibacter總量的比例低于0.32%.Type II中以IIC為主，IID、IIA次之，IIB含量較不豐富，而IA豐度最小.這與實驗室規模的反應器中Accumulibacter的種群結構明顯不同，實驗室反應器富集的Accumulibacter主要以IA和IIA為主(He et al., 2010;Gonzalez-Gil et al., 2011).對于污水處理廠中Accumulibacter各進化枝的分布與EBPR性能之間的關系分析如下：
1)除磷效果不好可能和IID占總Accumulibacter比例較高有關.本課題組前期對實驗室規模的MUCT反應器中Accumulibacter種群進行反硝化除磷的研究，發現在以NO-2為電子受體的反硝化除磷系統中IID始終是優勢菌屬，占總Accumulibacter的90%以上(曾薇等，2013)，說明IID分支適合于以NO-2為電子受體進行缺氧吸磷.而實際污水處理廠是以O2為電子受體的好氧吸磷及以NO-3為電子受體的缺氧吸磷，IID比例的升高導致除磷效果變差.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
2)關于IIC在污水處理廠中的功能還需要進一步的研究.有報道稱IIC可以利用硝酸鹽為電子受體進行缺氧吸磷(Kim et al., 2013)，但也有報道稱IIC是導致EBPR系統惡化的原因(Slater et al., 2010).由此可見，在系統發育上屬于同一進化枝的Accumulibacter由于工藝和運行條件的不同可能會具有不同的功能.
4 結論
1)QPCR結果表明，Accumulibacter 6個進化枝(IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)存在于12個污泥樣品中，占污水處理系統中總菌的比例平均為9.17%.A2O工藝及其改良工藝中總Accumulibacter豐度最高，占到總菌的22.8%，具有較好的生物除磷性能.分支IIC在11種工藝中均豐度最高，平均占總Accumulibacter比例的75.34%.IID次之，占總Accumulibacter的比例平均為14.87%，IA豐度最低，占總Accumulibacter比例平均只有0.32%.
2)12個活性污泥樣品的系統發育分析也證實了Accumulibacter以Type II 為主，Type I少量存在.TypeII中以IIC、IID、IIA為主，IIB、IIF豐度偏低.
3)污水處理廠中Accumulibacter各進化枝的分布與EBPR性能之間存在一定關系.除磷效果不好可能和以亞硝酸鹽為電子受體的IID占總Accumulibacter比例較高有關.而IIC在污水處理廠中的功能還需要進一步的研究.
