1 引言
隨著抗生素廣泛使用，環(huán)境中檢測到的抗生素種類繁多，其環(huán)境殘留濃度也逐年升高.另外，由于抗生素對生態(tài)平衡的影響和人體健康潛在威脅的暴露，抗生素的環(huán)境行為倍受人們關(guān)注.目前，國內(nèi)外學者對抗生素的研究主要集中在其環(huán)境殘留，對微生物、動植物的毒理作用，以及其抗性基因的檢測，而對其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化特征報道較少.紅霉素(Erythromycin，ERY)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有廣譜的抗菌作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)，是經(jīng)常使用且環(huán)境檢出率較高的抗生素之一.環(huán)境中檢測出的紅霉素多以脫水紅霉素(Anhydroerythromycin，ERY-H2O)形式存在，紅霉素及脫水紅霉素的分子結(jié)構(gòu)如圖 1所示.據(jù)報道，在中國各流域中，如長江、珠江、嘉陵江等都能檢測到紅霉素的存在，并且濃度呈上升趨勢.例如，在香港維多利亞港紅霉素濃度在2007年時為3.5~5.2 ng · L-1，2009年上升到4.7～1900 ng · L-1.水環(huán)境中廣泛檢出的紅霉素將如何在水生生態(tài)系統(tǒng)中遷移并產(chǎn)生怎樣的生態(tài)效應(yīng)，無疑是評估紅霉素的生態(tài)風險所必需了解的.目前，圍繞抗生素在水生生態(tài)系統(tǒng)中分布特征的研究多基于實際環(huán)境采樣分析，由于無法控制污染源和實驗條件，所得實驗結(jié)果多存在誤差，不利于正確評估抗生素的環(huán)境風險.采用微宇宙實驗裝置建立模擬水生生態(tài)系統(tǒng)由于具有體積小、易操作、且可人為控制其各理化性質(zhì)與自然環(huán)境相似的優(yōu)點，被廣泛用于研究污染物在生態(tài)系統(tǒng)中遷移和生態(tài)效應(yīng).本文選用紅霉素為代表抗生素，采用微宇宙實驗裝置建立模擬水生生態(tài)系統(tǒng)，研究紅霉素在水、沉積物及生物體不同相中的分布特征，以期為正確評價紅霉素以及抗生素的環(huán)境風險提供科學依據(jù).
?圖 1 紅霉素結(jié)構(gòu)圖(a)和脫水紅霉素結(jié)構(gòu)圖(b)
2 材料與方法
2.1 實驗材料
脫水紅霉素(純度> 95%)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司，-20 ℃保存;乙腈和甲醇均為色譜純，購自上海安譜科學儀器有限公司，其他試劑均為分析純，購自國藥試劑有限公司;實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備(Merck Millipore Advantage A10).
模擬生態(tài)系統(tǒng)所用水蘊草(Elodea densa)及斑馬魚(Barchydanioreriovar)購自廣州芳村花鳥魚蟲市場.水蘊草平均濕重為6.63 g ·棵-1，含水率為84.24%;斑馬魚平均重量為0.0656 g ·條-1.
2.2 實驗設(shè)計
微宇宙系統(tǒng)建立:微宇宙實驗裝置參考美國環(huán)保署的標準方法(Acute Dermal Toxicity，1996)采用室內(nèi)靜水養(yǎng)殖系統(tǒng)箱構(gòu)建.向養(yǎng)殖箱(80 cm×40 cm)內(nèi)加入約20 kg的沉積物，然后加60 L水.栽入水蘊草，老化運行一段時間后，放入經(jīng)馴化的斑馬魚，實驗期間室內(nèi)溫度控制在(30±2)℃，pH值控制在7.0±0.2、溶氧>4 mg · L-1.系統(tǒng)穩(wěn)定后，加入脫水紅霉素溶液(用3 mol · L-1 H2SO4調(diào)節(jié)紅霉素溶液的pH值到3.0，在室溫下攪拌4 h)，使系統(tǒng)水相紅霉素濃度達到500 μg · L-1.分別在0、0.5、1、4、7、10、14、21、30 d取樣，分別檢測水、沉積物、水草和魚中脫水紅霉素的含量，每種樣品設(shè)3個平行樣.
空白對照實驗:把1 L 500 μg · L-1紅霉素溶液倒在燒杯中，放置在與微宇宙系統(tǒng)相同的位置，分別在0、0.5、1、4、7、10、14、21、30 d取樣，檢測水中紅霉素濃度.
2.3 樣品預處理
水樣預處理參考吳維等(2011)測定飲用水體中抗生素殘留的方法:水樣過0.45 μm混合纖維樹脂濾膜，用3.0 mol · L-1 H2SO4溶液調(diào)節(jié)水樣pH，然后用預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進行富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹至近干，最后用甲醇定容，待測.
沉積物和水草預處理參考徐維海(2007)測定珠江沉積物中抗生素含量的方法:樣品經(jīng)冷凍干燥研磨后，稱取適量置于離心管中，加入15 mL乙腈/檸檬酸鉀緩沖溶液(按體積比1∶1)，超聲提取15 min，離心，轉(zhuǎn)移上清液，并重復提取3次;合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入 Na2EDTA溶液重溶，然后加入預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進行凈化富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹掃至近干，最后用甲醇定容，待測.
魚預處理參考Jo等(Jo et al., 2011)檢測魚體和蝦內(nèi)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素殘留的方法:樣品經(jīng)冷凍干燥研磨后，稱取適量樣品置于離心管中，向離心管中加入10 mL乙腈，超聲提取15 min，離心，轉(zhuǎn)移上清液，重復提取3次，合并上清液.向提取液中加入正己烷，振蕩去脂10 min，離心，除去正己烷層，重復去脂1次;提取液旋蒸至近干，然后加入 Na2EDTA溶液重溶，再加入預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進行凈化富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹掃至近干，最后用甲醇定容，待測.
2.4 分析方法
紅霉素采用Agilent 1200 高效液相色譜和Agilent 6410 Triple Quad串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測.色譜條件:色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5μm)，前接ODS Hypersil預柱(2.1 mm×10 mm，5 μm);柱溫30 ℃，流動相:乙腈(A)∶0.5% 甲酸溶液(B)=90∶10;流速0.25 mL/min;進樣量10 μL.質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧(Electrospray ionization，ESI)，正離子掃描;監(jiān)測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)，電噴霧電壓:4000 V;干燥氣:N2(11 L · min-1，300 ℃);霧化氣壓力:15 psi.
2.5 數(shù)據(jù)分析模型
一級動力學模型:
?式中，C0為水相中化合物初始濃度(ng · mL-1);t為時間(d);Ct為時間t時水相中化合物濃度(ng · mL-1).
沉積物-水分配系數(shù)Kd:
?式中，CS為沉積物中化合物含量(ng · g-1);CW為水相中化合物濃度(ng · mL-1).
生物富集系數(shù)BCF：
?式中，CB為生物體內(nèi)化合物含量(ng · g-1);CW為水相中化合物濃度(ng · mL-1).
3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 紅霉素在水體和沉積物中的變化
水中紅霉素濃度隨時間變化如圖 2所示.從圖中可以看出，紅霉素在水相的濃度隨著時間的增加逐漸減小.加藥12 h后，水中紅霉素濃度由初始的503.86 ng · mL-1迅速降到298.56 ng · mL-1，然后平緩降至30 d的188.14 ng · mL-1，水中紅霉素消減率為62.66%.從空白對照實驗數(shù)據(jù)可以看出，水相紅霉素30 d的消減率為12.96%.由于紅霉素屬難揮發(fā)化合物，系統(tǒng)水相紅霉素濃度的減少可能主要是遷移至系統(tǒng)中其他相的緣故.
?圖 2 水中紅霉素濃度隨時間變化
紅霉素在沉積物中的含量隨時間的變化如圖 3所示.從圖中可以看出，紅霉素在沉積物中的含量持續(xù)上升. 30 d時沉積物中紅霉素含量升至973.95 ng · g-1，這可能是與沉積物對紅霉素的吸附有關(guān).這與文獻報道相符，土壤和沉積物對抗生素表現(xiàn)出較強的吸附能力，且主要受沉積物的有機物含量影響(Liang et al., 2013).沉積物中富含的有機質(zhì)可提供陽離子交換位點，促進紅霉素在沉積物上的吸附.
?3.2 紅霉素在生物體中的含量變化
圖 4說明了紅霉素在水草和斑馬魚體內(nèi)含量隨時間的變化情況.從圖中可以看出，水草中紅霉素的含量在3 d時達到最高值12581.27 ng · g-1，然后維持在一個穩(wěn)定值，在15 d時水草中紅霉素含量開始下降，于30 d時降至6745.96 ng · g-1，這可能與水草的生理特性有關(guān).水生植物的表皮薄，可直接從水中吸收水分和養(yǎng)分.初始紅霉素在水相的濃度較高，水中的紅霉素在濃度梯度作用下自由擴散被吸收進入水草體內(nèi)，并在體內(nèi)積累;由于水生植物對紅霉素有代謝降解作用(Pomati et al., 2004)，進入水草體內(nèi)的紅霉素存在吸收和降解的平衡，故水草中紅霉素含量維持相對穩(wěn)定;之后，隨著水相紅霉素濃度的降低，水草從水中吸收紅霉素速度減慢，慢于其代謝紅霉素的速率，水草內(nèi)紅霉素濃度開始下降.
?圖 4 生物體中紅霉素隨時間變化
斑馬魚體內(nèi)紅霉素含量隨時間的變化大致相同，呈現(xiàn)先增加后下降的規(guī)律.在3 d時達到最高值1285.42 ng · g-1，不同之處在于，斑馬魚體內(nèi)沒有吸收與降解的平衡過程.3 d后即開始減少，30 d時斑馬魚體內(nèi)紅霉素濃度降到308.52 ng · g-1，這可能是與水生魚類與水生植物對污染物的吸收代謝作用存在差別有關(guān).魚類通過腮呼吸、皮膚接觸或攝食水中微生物和懸浮顆粒吸收水中紅霉素;同時，可通過新陳代謝或排泄作用將紅霉素轉(zhuǎn)化或排出.這與文獻報道結(jié)果相一致，Vendrell等(Vendrell et al., 2012)研究了紅霉素在虹鱒魚體內(nèi)富集與代謝動力學特性發(fā)現(xiàn):虹鱒魚對紅霉素有代謝降解作用，在實驗初始時虹鱒魚體內(nèi)紅霉素濃度為1173.83 ng · g-1，在第8 d時虹鱒魚體內(nèi)紅霉素濃度低于檢測限.
3.3 紅霉素在水生生態(tài)系統(tǒng)中的分布規(guī)律
圖 5為紅霉素在模擬生態(tài)系統(tǒng)各相的分布情況.從圖中可以看出，水中紅霉素逐漸減少.用一級動力學方程對紅霉素在空白試驗和模擬生態(tài)系統(tǒng)水相中的消減數(shù)據(jù)進行擬合，擬合參數(shù)如表 2所示.從擬合結(jié)果可以看出，紅霉素在空白實驗中的半衰期為113 d，而在模擬生態(tài)系統(tǒng)水相中的半衰期為42 d，這主要是由于模擬生態(tài)系統(tǒng)中其它相的存在促進了水相中紅霉素的消減.Carstens等(Carstens et al., 2013)曾研究磺胺在水-底泥模擬生態(tài)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):磺胺在不同水-底泥模擬生態(tài)系統(tǒng)水相中半衰期為2.7~17.8 d，與之相比，紅霉素的殘留時間更長，應(yīng)當考慮其對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響.
?圖 5 紅霉素在模擬系統(tǒng)中的分布規(guī)律(a)和生物體中所占投加量百分比
表 2 紅霉素在水相中的一級動力學擬合參數(shù)
?紅霉素進入模擬生態(tài)系統(tǒng)后將發(fā)生遷移.沉積物是紅霉素的主要富集場所.為了評價其在沉積物中的積累能力，這里用沉積物-水分配系數(shù)來進行評估.Kd值越大，則積累能力越強.通過計算得出，紅霉素的最高Kd值為5.18 L · kg-1，與文獻報道數(shù)據(jù)相一致.Zhang等(Zhang et al., 2011)報道了泰樂菌素在不同農(nóng)業(yè)土壤上的Kd在1.7到12 L · kg-1之間;Thiele和Tolls(Thiele，2000; Tolls，2001)報道，磺胺類抗生素在不同pH和有機質(zhì)含量的土壤上Kd為2.4和3 L · kg-1.而Liang等(Liang et al., 2013)采集實際沉積物樣品計算得出，脫水紅霉素在珠江口沉積物中的Kd為105 L · kg-1，Kim等(Kim and Carlson，2007)算得紅霉素在Cache La Poudre河中的采集的實際樣品的分配系數(shù)Kd為211 L · kg-1.可見根據(jù)實際樣品計算的分配系數(shù)顯著高于實驗所得，這可能是由于實際環(huán)境中沉積物中的紅霉素是長期積累的結(jié)果，因此并不能真實反映沉積物對抗生素的實際積累能力.因此，僅通過對實際環(huán)境樣品進行采樣分析得出的沉積物-水分配系數(shù)，可能會高估沉積物的積累能力.具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。
同時，水草和斑馬魚對紅霉素也表現(xiàn)出一定的富集作用.生物富集系數(shù)BCF是評估化合物在水生生物體內(nèi)富集情況，以及評估化合物對生物體毒性的重要參數(shù).通過計算紅霉素在斑馬魚和水草體內(nèi)的生物富集系數(shù)BCF，對紅霉素在斑馬魚和水草體內(nèi)的富集情況進行比較，發(fā)現(xiàn):紅霉素在水草中的富集能力高于斑馬魚.計算所得紅霉素在水草中的富集系數(shù)BCF最高值達到46.05 L · kg-1，而在斑馬魚體內(nèi)則僅為4.40 L · kg-1，相差一個數(shù)量級.化合物在生物體的富集除了和生物體的脂肪含量相關(guān)外，還與化合物在生物體代謝速率有關(guān).紅霉素在水草中的富集能力比在斑馬魚體內(nèi)高，可能是與紅霉素在斑馬魚體內(nèi)的代謝速率較快有關(guān).Liu等(Liu et al., 2013)研究羅紅霉素在鯽魚體內(nèi)的富集、代謝發(fā)現(xiàn):羅紅霉素在鯽魚肝、血液、腮和肌肉的BCFs分別為2.15~38.0、0.950~20.7、0.0506~19.7和0.0439~13.8 L · kg-1，同時研究指出魚體血液中羅紅霉素的代謝產(chǎn)物與人體血液羅紅霉素的代謝產(chǎn)物一致.根據(jù)國際的生物蓄積性標準BCF > 5000 L · kg-1判斷，紅霉素屬于非生物累積性物質(zhì).但需要注意的是，盡管紅霉素屬于非生物累積性物質(zhì)，卻依然可對水生生物產(chǎn)生一定的毒性作用.紅霉素在水草中富集量少，但其含量已達到6000 ng · g-1以上，顯著高于文獻報道的最大半數(shù)有效濃度0.036 mg · L-1，而且據(jù)Eguchi等(Eguchi et al., 2004)的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度紅霉素即可對水生植物的生長產(chǎn)生影響，Vannini等(Vannini et al., 2011)的研究指出抗生素被水生植物吸收后主要富集葉綠體及光合器內(nèi)，進而抑制其的光合作用，而光合作用是生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ).對于魚類而言，Kiryu等(Kiryu and Moffitt， 2002)研究紅霉素對4種不同鮭魚半數(shù)致死劑量LD50為350~1041 mg · kg-1.雖然本研究中魚體內(nèi)的紅霉素濃度低于文獻報道的半數(shù)致死劑量，但根據(jù)美國科學院的毒性物質(zhì)危險劃分標準，從斑馬魚對紅霉素的富集能力看，紅霉素對魚類的毒性依然表現(xiàn)出輕度毒性.由于紅霉素在水生植物體內(nèi)的代謝能力低于魚類，同時又表現(xiàn)出一定的毒性和敏感性，因此，在評估紅霉素的生態(tài)環(huán)境風險時，應(yīng)注意其對水生植物的影響.
4 結(jié)論
紅霉素進入模擬水生生態(tài)系統(tǒng)后，水相的半衰期為42 d，沉積物為主要富集場所，可積累56.46%的紅霉素;同時，水草和斑馬魚對紅霉素亦有一定的吸收富集能力，水草和斑馬魚可分別吸收和富集1.04%和0.0402%的紅霉素;水草對紅霉素的富集能力高于斑馬魚，其最高富集系數(shù)在水草和斑馬魚內(nèi)分別為46.05 L · kg-1和4.40 L · kg-1，在考慮評估紅霉素的生態(tài)環(huán)境風險時，應(yīng)注意其對水生動植物的影響.
